表于 Nature Biomedical Engineering 的《 High‑throughput evaluation of in vitro CRISPR activities enables optimized large‑scale multiplex enrichment of rare variants 》开发了两种体外高通量测定方法 Cut‑seq1 和 Cut‑seq2 ，用于评估成千上万对 sgRNA–靶序列配对的 Cas9 切割效率。结果显示，体外切割指数与细胞内 indel 频率相关性仅约 r≈0.27，但 PAM 兼容性的相关性接近 r≈0.99。基于约 18 万组数据构建的深度学习模型预测切割比值的相关性达 r≈0.90。利用该模型选择优化 sgRNA，并通过 CLOVE‑seq 实现平均约 900 倍的稀有变体等位基因频率富集，超过 80% 的突变被检测到。

以往针对大量靶序列与导向RNA（guide RNA, gRNA）的高通量CRISPR活性评估，多依赖插入–缺失突变（indel）频率而非切割效率。研究人员开发了两种高通量体外测定方法——Cut-seq1 与 Cut-seq2，可评估成千上万甚至上十万种Cas9-gRNA–靶序列配对的切割效率。结果显示，体外切割效率与细胞中indel频率相关性较低，但与PAM序列兼容性高度一致。

基于这些大规模体外切割效率数据，研究人员构建了DeepCut深度学习模型，用于识别最优单导向RNA（sgRNA），可在噪声序列存在时仍特异切割目标序列。进一步，研究人员开发了CLOVE-seq（Cleavage for Large-scale Optimized Variant Enrichment Sequencing）方法，通过Cas9介导的特异性切割实现稀有变体的多重富集。该体系不仅提升了对CRISPR核酸酶活性的理解，也为多种生物医学场景下稀有变体检测提供了可扩展的技术路线。

在哺乳动物细胞中进行的高通量 sgRNA–靶序列活性评估使得机器学习模型能准确预测 CRISPR 活性。然而，这些评估通常依赖于 indel 频率，而非直接的切割效率。细胞内的 indel 频率受到非同源末端连接误差率、染色质状态及 DNA 可及性等多重因素影响。因此，在可控条件下直接测量切割效率（如体外实验）对于理解 CRISPR 生物学至关重要。但此前的体外评估方法通常仅能分析少数 sgRNA，难以实现大规模并行评估。

为此，研究人员设计了可容纳数十万 sgRNA–靶序列对的体外体系，并进一步结合深度学习模型，实现对 sgRNA 切割活性、选择性及稀有变体富集的全面分析。

|| 方法概述

研究人员利用固定化的大肠杆菌作为反应单元，构建了含有 2,000 至 120,000 对 sgRNA–靶序列的质粒文库（T7_2k 与 T7_120k）。通过体外转录与 Cas9 反应，结合接头连接与深度测序，研究人员建立了 Cut-seq1 方法以量化 Cas9 切割指数。进一步引入识别位点酶 EcoRV，使得未被切割的片段也能被检测，从而形成改进版本 Cut-seq2，以切割比值指数更准确反映酶活性。

此外，研究人员设计了针对癌症相关突变的噪声序列（WT）与稀有变体（MT）文库，用以评估不同 sgRNA 的选择性和富集效率。

|| 结果

Cut-seq1 的开发与验证

研究人员首先利用固定化细菌实现体外 CRISPR–Cas9 反应的空间分隔，并构建了 T7 启动子驱动的配对文库。深度测序显示两次生物学重复间的切割指数相关性极高（r = 0.95）。通过测试不同菌株与固定方法，确定了缺乏核酸内切酶 A 的大肠杆菌（EC100）和低温甲醇固定为最优条件。实验验证表明，反应体系中切割反应在单个细胞中实现良好分隔。

图1 Cut-seq1的开发与验证

体外与细胞内切割活性对比

为了比较体外切割效率与细胞内 indel 频率的关系，研究人员构建了使用 U6 启动子的文库（U6_120k），并在多种细胞系（HEK293T、HeLa、Hepa 1–6、B16-F10）中测定。结果显示不同细胞间的 indel 频率高度相关，但体外切割指数与细胞内 indel 频率的相关性较低（r ≈ 0.27），而 PAM 相容性在体外与细胞中则几乎一致（r ≈ 0.99）。这表明 indel 频率受细胞环境影响较大，而 PAM 识别规律具有普适性。

图2 Cas9在体外与细胞内的活性比较

sgRNA 差异性选择性与 Cut-seq2 的建立

研究人员构建了包含 30,772 对 sgRNA–靶序列的 Cut1_30k 文库，用以评估不同 Cas9 变体（SpCas9、HF1、SuperFi、evoCas9）及其在 1-bp 差异序列下的切割选择性。结果显示，高保真变体 HF1 与 SuperFi 具有更优的选择性指数（SI），且多数最佳区分 sgRNA 并非完全匹配，而是带有单碱基错配的“差异型 sgRNA”。基于此，研究人员改进为 Cut-seq2，可同时检测被切割与未切割序列，以切割比值指数更准确反映活性。

图3 差异 sgRNA 选择性及 Cut-seq2 方法

DeepCut 深度学习模型的建立与性能

利用 Cut-seq2 生成的 18 万余组 sgRNA–靶序列数据，研究人员开发了基于 Transformer 与卷积网络架构的 DeepCut-HF1、DeepCut-NRRH-HF1 与 DeepCut-NRCH-HF1 模型，用以预测切割比值指数。模型采用 sgRNA–靶序列配对编码及突变信息输入，显著优于传统机器学习方法，相关性高达 r = 0.90。

图4 DeepCut模型结构与性能评估

DeepCut 优化的 sgRNA 在稀有变体富集中的应用

研究人员利用 DeepCut 选取针对 2,612 个癌症突变的优化 sgRNA，构建了 optimized_HF1_2k 与 optimized_NRRH_2k 文库。通过多轮 Cas9 切割与 PCR 扩增（CLOVE-seq），研究人员在 7.8k 稀有变体文库中实现了高达 900 倍的平均等位基因频率提升，且超过 80% 的突变可被检测。相比之下，使用完全匹配 sgRNA 的富集效率明显较低。

图5 稀有变体多重富集效果

选择性机制与检测灵敏度分析

研究人员进一步分析了突变位置对选择性的影响，发现当突变位于 PAM 或 PAM 邻近的原间隔区时，富集效果最佳。此外，测序深度提高至 10,000× 后对检测灵敏度提升有限，说明该方法在标准深度下已具高稳定性。

图6 优化 sgRNA 介导的选择性切割与稀有变体检测策略示意

|| 讨论

研究人员通过 Cut-seq1 与 Cut-seq2 实现了迄今最大规模的体外 CRISPR 切割效率评估，并揭示体外活性与细胞内 indel 频率的差异来源于细胞环境复杂性。基于此构建的 DeepCut 模型不仅能准确预测体外切割效率，还能为 sgRNA 优化提供可解释性特征。结合 CLOVE-seq，研究人员实现了首个大规模稀有变体的高选择性、多重富集体系。该研究奠定了深度学习驱动的体外 CRISPR 优化与分子检测新范式，为未来临床基因变体检测、癌症早筛及个体化诊断提供了可扩展的技术基础。

参考资料

Yeo, J.H., Lee, S., Kim, S. et al. High-throughput evaluation of in vitro CRISPR activities enables optimized large-scale multiplex enrichment of rare variants. Nat. Biomed. Eng (2025).

https://doi.org/10.1038/s41551-025-01535-0

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文章改编转载自微信公众号：DrugAI

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表于 Nature Biomedical Engineering 的《 High‑throughput evaluation of in vitro CRISPR activities enables optimized large‑scale multiplex enrichment of rare variants 》开发了两种体外高通量测定方法 Cut‑seq1 和 Cut‑seq2 ，用于评估成千上万对 sgRNA–靶序列配对的 Cas9 切割效率。结果显示，体外切割指数与细胞内 indel 频率相关性仅约 r≈0.27，但 PAM 兼容性的相关性接近 r≈0.99。基于约 18 万组数据构建的深度学习模型预测切割比值的相关性达 r≈0.90。利用该模型选择优化 sgRNA，并通过 CLOVE‑seq 实现平均约 900 倍的稀有变体等位基因频率富集，超过 80% 的突变被检测到。

以往针对大量靶序列与导向RNA（guide RNA, gRNA）的高通量CRISPR活性评估，多依赖插入–缺失突变（indel）频率而非切割效率。研究人员开发了两种高通量体外测定方法——Cut-seq1 与 Cut-seq2，可评估成千上万甚至上十万种Cas9-gRNA–靶序列配对的切割效率。结果显示，体外切割效率与细胞中indel频率相关性较低，但与PAM序列兼容性高度一致。

基于这些大规模体外切割效率数据，研究人员构建了DeepCut深度学习模型，用于识别最优单导向RNA（sgRNA），可在噪声序列存在时仍特异切割目标序列。进一步，研究人员开发了CLOVE-seq（Cleavage for Large-scale Optimized Variant Enrichment Sequencing）方法，通过Cas9介导的特异性切割实现稀有变体的多重富集。该体系不仅提升了对CRISPR核酸酶活性的理解，也为多种生物医学场景下稀有变体检测提供了可扩展的技术路线。

在哺乳动物细胞中进行的高通量 sgRNA–靶序列活性评估使得机器学习模型能准确预测 CRISPR 活性。然而，这些评估通常依赖于 indel 频率，而非直接的切割效率。细胞内的 indel 频率受到非同源末端连接误差率、染色质状态及 DNA 可及性等多重因素影响。因此，在可控条件下直接测量切割效率（如体外实验）对于理解 CRISPR 生物学至关重要。但此前的体外评估方法通常仅能分析少数 sgRNA，难以实现大规模并行评估。

为此，研究人员设计了可容纳数十万 sgRNA–靶序列对的体外体系，并进一步结合深度学习模型，实现对 sgRNA 切割活性、选择性及稀有变体富集的全面分析。

|| 方法概述

研究人员利用固定化的大肠杆菌作为反应单元，构建了含有 2,000 至 120,000 对 sgRNA–靶序列的质粒文库（T7_2k 与 T7_120k）。通过体外转录与 Cas9 反应，结合接头连接与深度测序，研究人员建立了 Cut-seq1 方法以量化 Cas9 切割指数。进一步引入识别位点酶 EcoRV，使得未被切割的片段也能被检测，从而形成改进版本 Cut-seq2，以切割比值指数更准确反映酶活性。

此外，研究人员设计了针对癌症相关突变的噪声序列（WT）与稀有变体（MT）文库，用以评估不同 sgRNA 的选择性和富集效率。

|| 结果

Cut-seq1 的开发与验证

研究人员首先利用固定化细菌实现体外 CRISPR–Cas9 反应的空间分隔，并构建了 T7 启动子驱动的配对文库。深度测序显示两次生物学重复间的切割指数相关性极高（r = 0.95）。通过测试不同菌株与固定方法，确定了缺乏核酸内切酶 A 的大肠杆菌（EC100）和低温甲醇固定为最优条件。实验验证表明，反应体系中切割反应在单个细胞中实现良好分隔。

图1 Cut-seq1的开发与验证

体外与细胞内切割活性对比

为了比较体外切割效率与细胞内 indel 频率的关系，研究人员构建了使用 U6 启动子的文库（U6_120k），并在多种细胞系（HEK293T、HeLa、Hepa 1–6、B16-F10）中测定。结果显示不同细胞间的 indel 频率高度相关，但体外切割指数与细胞内 indel 频率的相关性较低（r ≈ 0.27），而 PAM 相容性在体外与细胞中则几乎一致（r ≈ 0.99）。这表明 indel 频率受细胞环境影响较大，而 PAM 识别规律具有普适性。

图2 Cas9在体外与细胞内的活性比较

sgRNA 差异性选择性与 Cut-seq2 的建立

研究人员构建了包含 30,772 对 sgRNA–靶序列的 Cut1_30k 文库，用以评估不同 Cas9 变体（SpCas9、HF1、SuperFi、evoCas9）及其在 1-bp 差异序列下的切割选择性。结果显示，高保真变体 HF1 与 SuperFi 具有更优的选择性指数（SI），且多数最佳区分 sgRNA 并非完全匹配，而是带有单碱基错配的“差异型 sgRNA”。基于此，研究人员改进为 Cut-seq2，可同时检测被切割与未切割序列，以切割比值指数更准确反映活性。

图3 差异 sgRNA 选择性及 Cut-seq2 方法

DeepCut 深度学习模型的建立与性能

利用 Cut-seq2 生成的 18 万余组 sgRNA–靶序列数据，研究人员开发了基于 Transformer 与卷积网络架构的 DeepCut-HF1、DeepCut-NRRH-HF1 与 DeepCut-NRCH-HF1 模型，用以预测切割比值指数。模型采用 sgRNA–靶序列配对编码及突变信息输入，显著优于传统机器学习方法，相关性高达 r = 0.90。

图4 DeepCut模型结构与性能评估

DeepCut 优化的 sgRNA 在稀有变体富集中的应用

研究人员利用 DeepCut 选取针对 2,612 个癌症突变的优化 sgRNA，构建了 optimized_HF1_2k 与 optimized_NRRH_2k 文库。通过多轮 Cas9 切割与 PCR 扩增（CLOVE-seq），研究人员在 7.8k 稀有变体文库中实现了高达 900 倍的平均等位基因频率提升，且超过 80% 的突变可被检测。相比之下，使用完全匹配 sgRNA 的富集效率明显较低。

图5 稀有变体多重富集效果

选择性机制与检测灵敏度分析

研究人员进一步分析了突变位置对选择性的影响，发现当突变位于 PAM 或 PAM 邻近的原间隔区时，富集效果最佳。此外，测序深度提高至 10,000× 后对检测灵敏度提升有限，说明该方法在标准深度下已具高稳定性。

图6 优化 sgRNA 介导的选择性切割与稀有变体检测策略示意

|| 讨论

研究人员通过 Cut-seq1 与 Cut-seq2 实现了迄今最大规模的体外 CRISPR 切割效率评估，并揭示体外活性与细胞内 indel 频率的差异来源于细胞环境复杂性。基于此构建的 DeepCut 模型不仅能准确预测体外切割效率，还能为 sgRNA 优化提供可解释性特征。结合 CLOVE-seq，研究人员实现了首个大规模稀有变体的高选择性、多重富集体系。该研究奠定了深度学习驱动的体外 CRISPR 优化与分子检测新范式，为未来临床基因变体检测、癌症早筛及个体化诊断提供了可扩展的技术基础。

参考资料

Yeo, J.H., Lee, S., Kim, S. et al. High-throughput evaluation of in vitro CRISPR activities enables optimized large-scale multiplex enrichment of rare variants. Nat. Biomed. Eng (2025).

https://doi.org/10.1038/s41551-025-01535-0

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文章改编转载自微信公众号：DrugAI

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