2026年7月13日，华盛顿大学蛋白质设计研究所、Fred Hutchinson癌症中心、加州理工学院和西班牙Miguel Hernández大学等机构的研究团队在bioRxiv发布预印本《De novo design of selective kinase modulators》。研究利用RFdiffusion等蛋白设计方法，从头生成可遗传编码的小型蛋白，通过结合激酶结构域的不同构象，选择性抑制或激活黏着斑激酶FAK，并进一步把抑制骨架重定向至Src激酶。其核心进展是同一套结构导向设计流程能够在不直接竞争保守ATP位点的情况下，对激酶活性实施双向、细胞内和可迁移的调控。

 

背景

蛋白激酶控制细胞生长、存活与迁移，是肿瘤等疾病中的核心药物靶点。传统小分子抑制剂多占据ATP结合口袋，但这一位点在不同激酶之间高度保守，容易产生脱靶和毒性。另一方面，激酶结构域并非静态结构，而是在多种活性样和非活性样构象之间转换；DFG基序、αC螺旋、甘氨酸富集环和激活片段的相对位置，共同决定催化几何是否成立。

活性构象受到催化功能约束，跨激酶往往更为相似；非活性构象则具有更大的结构差异。由此产生一种不同于ATP竞争的策略：在激酶表面寻找构象敏感、序列不那么保守的调节区域，以设计蛋白稳定特定状态。若稳定催化兼容构象，可能增强活性；若把局部几何推向开放或错位状态，则可能抑制活性。研究选择与肿瘤转移和细胞迁移密切相关的FAK作为首个测试对象。

FAK位于整合素信号下游，连接细胞外基质感知、黏着斑组装与细胞迁移，在三阴性乳腺癌、卵巢癌和胰腺导管腺癌等疾病中常出现过表达或高活化。FAK抑制剂defactinib与FAK-MEK钳制剂avutometinib的联合方案已获FDA用于KRAS突变低级别浆液性卵巢癌，说明这一靶点具有现实治疗价值；但本研究的小蛋白更重要的近期用途，是在细胞内精确提高或降低FAK活性，从而解析不同信号强度与黏附、迁移和存活表型之间的关系。

相较于抑制，人工激活激酶更具挑战。抑制剂只需阻断ATP、底物结合或破坏必要几何，激活剂则必须提高催化有效状态在整个构象集合中的占比，同时避免把蛋白固定在一个虽可结合却不能周转的状态。既往工程化monobody已证明蛋白支架可以变构改变激酶平衡，本研究进一步尝试由生成式模型直接创造全新支架，并让激活与抑制从同一套流程中产生。

多构象设计：把FAK的结构动态转化为可编程靶点

团队没有把FAK简单分成唯一的“开”和“关”状态，而是选择2J0L、4D4R、4D5H、4K9Y、1MP8和4D55等多种激酶结构作为模板，覆盖N端叶和C端叶相对取向以及ATP口袋附近的局部差异。研究以甘氨酸富集环附近的430位残基和DFG/ATP位点邻近的552位残基之间距离，描述口袋的紧凑或开放程度，并在ATP位点邻近及叶间调节表面选择暴露疏水区域作为结合位置。

RFdiffusion首先生成80–120个残基的结合骨架，ProteinMPNN为每个骨架设计序列，Rosetta FastRelax优化界面和单体稳定性，AlphaFold2筛选能够按预期折叠并以高置信度结合FAK的候选；表现最好的设计再经过部分扩散和新一轮序列设计。最终进入实验的96个候选多为约100个氨基酸、以螺旋为主的单结构域小蛋白。

这套流程保留了计算设计与实验筛选之间的明确分工。结构模型负责规定结合区域和希望稳定的构象，从而把搜索空间集中到功能相关表面；SPR、FRET和放射性激酶实验则分别验证是否结合、是否改变周转速度以及磷酸转移是否真正变化。96个候选中约三分之一产生功能调节，说明计算模型显著提高了定向发现效率，但仍不能取代实验，因为多数高评分结构并未形成强功能输出。

图1 从FAK多构象模板到功能筛选的设计流程。RFdiffusion生成骨架，ProteinMPNN设计序列，Rosetta与AlphaFold2完成优化和结构筛选；FRET实验从候选中识别抑制剂FAK_I1/FAK_I2和激活剂FAK_A1/FAK_A2。

功能筛选：96个设计中获得33个FAK调节蛋白

候选蛋白经半自动化表达纯化后，先在500 nM单浓度条件下通过表面等离子体共振评估结合，再进入高通量FRET激酶生物传感器实验。活性FAK磷酸化底物后使FRET信号下降，因此信号下降加快提示激活，维持较高FRET则提示抑制。96个设计中，30个抑制FAK、3个增强活性，其余候选影响有限。

四个最强设计呈现清晰的双向效应。FAK_A1和FAK_A2使生物传感器反映的活性提高约150%–200%；FAK_I1和FAK_I2则把活性压低至基线的约20%–30%。这一结果说明，设计流程并非仅产生仅结合而不调节的蛋白，而是能够通过选取和稳定不同构象，改变同一激酶的催化输出方向。

低纳摩尔抑制与超过两倍激活得到生化确认

SPR定量显示，FAK_I1和FAK_I2与FAK的解离常数KD分别为2.7 nM和19 nM；激活剂FAK_A1和FAK_A2的KD约为391 nM和4.9 nM。放射性激酶实验直接测量γ-32P向肽底物的转移，FAK_I1和FAK_I2的IC50分别为22±3 nM和17±3 nM，确认其低纳摩尔抑制效力。

两种激活剂则随浓度提高而增加磷酸掺入。FAK_A1的EC50为18±9 nM，总32P掺入量约为FAK单独反应的两倍；FAK_A2的EC50为2.8±0.9 nM，激活幅度更高。结合亲和力并不与功能强度简单一一对应，说明调节效应还取决于结合位点如何改变构象平衡，而不只是“结合得有多紧”。

图2 四种主要FAK调节蛋白的结合与生化活性。FAK_I1和FAK_I2表现为低纳摩尔抑制剂，FAK_A1和FAK_A2以浓度依赖方式增强催化活性。

2.04 Å晶体结构揭示构象调节的物理基础

为验证设计几何，团队解析了FAK激酶结构域与激活剂FAK_A1复合物的2.04 Å晶体结构。以激酶链叠合后，结合蛋白主链与设计模型的偏差约为1.0 Å，结合蛋白自身折叠的主链RMSD仅0.28 Å，说明设计界面在接近原子级精度上得到实验复现。FAK_A1横跨激酶N端叶、C端叶及连接两者的铰链区，并未引发激酶核心的大规模变形。FAK_A1、FAK_A2、FAK_I1和FAK_I2模型的C端叶高度重合，Cα RMSD为0.15–0.30 Å，但N端叶相对位置不同。跨49个AlphaFold3模型分析发现，430–552位Cα距离与活性倍数呈负相关，Pearson r为−0.60：激活设计接近紧凑的参考几何，抑制设计则对应更开放或位移的ATP口袋邻近构象。

图3 FAK_A1晶体结构与设计模型高度吻合。局部ATP口袋几何与功能输出相关，430–552位Cα距离增大与活性降低相关（r=−0.60，n=49）。

选择性来自非保守表面，而非保守ATP口袋

选择性是激酶调节剂能否成为可靠工具的关键。研究在2 μM条件下，将FAK_I1和FAK_I2对FAK、IRAK4、EGFR、CK1γ1、ROCK1、GSK3β、SYK、MNK1、MAPKAPK2和ZAP70组成的10种激酶面板进行测试。该浓度约为FAK_I1 IC50的90倍、FAK_I2 IC50的120倍。即便远高于半数抑制浓度，两种设计仍强烈抑制FAK，而对其他激酶的作用显著较低或可忽略，其中包括与FAK较接近的酪氨酸激酶EGFR、SYK和ZAP70。结果支持通过非保守构象表面获得选择性的设想，但面板只覆盖10种激酶，尚不能替代更全面的激酶组、蛋白组和细胞脱靶评估。

图4 FAK_I1和FAK_I2在2 μM下的激酶选择性。两种设计强烈抑制FAK，而对面板中其他9种激酶的影响较低或可忽略。

在细胞中实现FAK信号的抑制与增强

团队通过慢病毒在FAK扩增且依赖FAK的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中稳定表达四种设计蛋白。所有调节蛋白都能不同程度保护内源FAK免受PROTAC BSJ-04-146降解，提供了细胞内靶点结合的独立证据。与体外结果一致，FAK_I1和FAK_I2降低FAK主要自磷酸化位点Y397的磷酸化，而FAK_A1和FAK_A2提高其磷酸化水平。

功能表型也呈相反方向。抑制剂减少细胞在I型胶原表面的铺展面积和黏着斑数量，激活剂则增强细胞铺展并增加黏着斑。FAK_I1和FAK_I2还显著降低MDA-MB-231三维球体的细胞活力；在胰腺导管腺癌细胞PATU-8988T中，两者同样降低磷酸化FAK和三维球体活力。图5中的铺展与黏着斑数据来自3次独立实验、每个条件超过15个细胞；三维球体实验每组包含10–20个生物学独立样本，并代表3次独立实验。

图5 设计蛋白在细胞内双向调节FAK信号与表型。抑制剂降低Y397磷酸化、细胞铺展、黏着斑和三维球体活力，激活剂产生相反的黏附表型。

从FAK重定向至Src：成功骨架可以快速改造

为检验方法的可迁移性，研究以成功的FAK抑制骨架为起点，把靶标替换为处于非活性或SH2结合构象的Src激酶，再通过RFdiffusion部分扩散重塑界面、ProteinMPNN重新设计序列，并用AlphaFold2筛选。与每个新靶点完全从零开始相比，这种策略保留总体骨架架构，只重构与新激酶接触的区域。

在HEK293细胞中，研究使用全长或截短Src与CD247 ITAM报告系统，通过全局磷酸酪氨酸信号和CD247 pY142位点评估活性。Src_I1产生最强且最稳定的抑制，Src_I2在两种Src背景中也降低两类读数；其他设计表现出不同程度的结构背景依赖性。这表明FAK设计不只是偶然命中，已验证骨架可以作为新激酶调节剂的界面重设计起点。

遗传编码还赋予这类调节剂区别于小分子的实验优势。设计蛋白可以与细胞类型特异启动子、亚细胞定位序列、光控或化学诱导模块融合，在特定时间和位置持续改变激酶状态；抑制剂和激活剂成对使用，还能帮助区分一个表型究竟来自FAK缺失、催化降低还是活性增强。这种双向扰动对于解析信号网络因果关系尤其重要，也可能用于构建带反馈控制的合成细胞回路，但所有这些用途仍需逐项实验证明。

总结：从抑制剂设计迈向可编程的激酶状态控制

这项工作把激酶设计从“寻找一个能结合的蛋白”推进到“规定结合后把活性推向哪个方向”。96个候选中获得33个功能调节剂，低纳摩尔抑制、超过两倍激活、2.04 Å结构验证、有限激酶面板中的高选择性，以及细胞内相反方向的信号和黏附表型，共同构成较完整的证据链。其科学价值不仅是得到FAK抑制剂，还在于证明构象敏感表面可以成为可编程的酶活性控制位点。

局限同样明确：选择性面板规模有限；细胞实验依赖稳定遗传表达，尚未检验体内递送、药代稳定性、免疫原性和动物或人体安全性；Src重定向主要提供细胞报告系统证据，尚未达到FAK部分的生化和结构验证深度。因此，这些小蛋白更适合被视为信号机制研究工具、空间或时间可控系统的构件，以及发现新型调节位点的起点。若递送和系统级特异性问题能够解决，遗传编码的激酶激活剂与抑制剂有望补充传统小分子，支持持续、细胞类型特异或亚细胞定位的信号调控。

参考链接

https://doi.org/10.64898/2026.07.10.737808

2026年7月13日，华盛顿大学蛋白质设计研究所、Fred Hutchinson癌症中心、加州理工学院和西班牙Miguel Hernández大学等机构的研究团队在bioRxiv发布预印本《De novo design of selective kinase modulators》。研究利用RFdiffusion等蛋白设计方法，从头生成可遗传编码的小型蛋白，通过结合激酶结构域的不同构象，选择性抑制或激活黏着斑激酶FAK，并进一步把抑制骨架重定向至Src激酶。其核心进展是同一套结构导向设计流程能够在不直接竞争保守ATP位点的情况下，对激酶活性实施双向、细胞内和可迁移的调控。

 

背景

蛋白激酶控制细胞生长、存活与迁移，是肿瘤等疾病中的核心药物靶点。传统小分子抑制剂多占据ATP结合口袋，但这一位点在不同激酶之间高度保守，容易产生脱靶和毒性。另一方面，激酶结构域并非静态结构，而是在多种活性样和非活性样构象之间转换；DFG基序、αC螺旋、甘氨酸富集环和激活片段的相对位置，共同决定催化几何是否成立。

活性构象受到催化功能约束，跨激酶往往更为相似；非活性构象则具有更大的结构差异。由此产生一种不同于ATP竞争的策略：在激酶表面寻找构象敏感、序列不那么保守的调节区域，以设计蛋白稳定特定状态。若稳定催化兼容构象，可能增强活性；若把局部几何推向开放或错位状态，则可能抑制活性。研究选择与肿瘤转移和细胞迁移密切相关的FAK作为首个测试对象。

FAK位于整合素信号下游，连接细胞外基质感知、黏着斑组装与细胞迁移，在三阴性乳腺癌、卵巢癌和胰腺导管腺癌等疾病中常出现过表达或高活化。FAK抑制剂defactinib与FAK-MEK钳制剂avutometinib的联合方案已获FDA用于KRAS突变低级别浆液性卵巢癌，说明这一靶点具有现实治疗价值；但本研究的小蛋白更重要的近期用途，是在细胞内精确提高或降低FAK活性，从而解析不同信号强度与黏附、迁移和存活表型之间的关系。

相较于抑制，人工激活激酶更具挑战。抑制剂只需阻断ATP、底物结合或破坏必要几何，激活剂则必须提高催化有效状态在整个构象集合中的占比，同时避免把蛋白固定在一个虽可结合却不能周转的状态。既往工程化monobody已证明蛋白支架可以变构改变激酶平衡，本研究进一步尝试由生成式模型直接创造全新支架，并让激活与抑制从同一套流程中产生。

多构象设计：把FAK的结构动态转化为可编程靶点

团队没有把FAK简单分成唯一的“开”和“关”状态，而是选择2J0L、4D4R、4D5H、4K9Y、1MP8和4D55等多种激酶结构作为模板，覆盖N端叶和C端叶相对取向以及ATP口袋附近的局部差异。研究以甘氨酸富集环附近的430位残基和DFG/ATP位点邻近的552位残基之间距离，描述口袋的紧凑或开放程度，并在ATP位点邻近及叶间调节表面选择暴露疏水区域作为结合位置。

RFdiffusion首先生成80–120个残基的结合骨架，ProteinMPNN为每个骨架设计序列，Rosetta FastRelax优化界面和单体稳定性，AlphaFold2筛选能够按预期折叠并以高置信度结合FAK的候选；表现最好的设计再经过部分扩散和新一轮序列设计。最终进入实验的96个候选多为约100个氨基酸、以螺旋为主的单结构域小蛋白。

这套流程保留了计算设计与实验筛选之间的明确分工。结构模型负责规定结合区域和希望稳定的构象，从而把搜索空间集中到功能相关表面；SPR、FRET和放射性激酶实验则分别验证是否结合、是否改变周转速度以及磷酸转移是否真正变化。96个候选中约三分之一产生功能调节，说明计算模型显著提高了定向发现效率，但仍不能取代实验，因为多数高评分结构并未形成强功能输出。

图1 从FAK多构象模板到功能筛选的设计流程。RFdiffusion生成骨架，ProteinMPNN设计序列，Rosetta与AlphaFold2完成优化和结构筛选；FRET实验从候选中识别抑制剂FAK_I1/FAK_I2和激活剂FAK_A1/FAK_A2。

功能筛选：96个设计中获得33个FAK调节蛋白

候选蛋白经半自动化表达纯化后，先在500 nM单浓度条件下通过表面等离子体共振评估结合，再进入高通量FRET激酶生物传感器实验。活性FAK磷酸化底物后使FRET信号下降，因此信号下降加快提示激活，维持较高FRET则提示抑制。96个设计中，30个抑制FAK、3个增强活性，其余候选影响有限。

四个最强设计呈现清晰的双向效应。FAK_A1和FAK_A2使生物传感器反映的活性提高约150%–200%；FAK_I1和FAK_I2则把活性压低至基线的约20%–30%。这一结果说明，设计流程并非仅产生仅结合而不调节的蛋白，而是能够通过选取和稳定不同构象，改变同一激酶的催化输出方向。

低纳摩尔抑制与超过两倍激活得到生化确认

SPR定量显示，FAK_I1和FAK_I2与FAK的解离常数KD分别为2.7 nM和19 nM；激活剂FAK_A1和FAK_A2的KD约为391 nM和4.9 nM。放射性激酶实验直接测量γ-32P向肽底物的转移，FAK_I1和FAK_I2的IC50分别为22±3 nM和17±3 nM，确认其低纳摩尔抑制效力。

两种激活剂则随浓度提高而增加磷酸掺入。FAK_A1的EC50为18±9 nM，总32P掺入量约为FAK单独反应的两倍；FAK_A2的EC50为2.8±0.9 nM，激活幅度更高。结合亲和力并不与功能强度简单一一对应，说明调节效应还取决于结合位点如何改变构象平衡，而不只是“结合得有多紧”。

图2 四种主要FAK调节蛋白的结合与生化活性。FAK_I1和FAK_I2表现为低纳摩尔抑制剂，FAK_A1和FAK_A2以浓度依赖方式增强催化活性。

2.04 Å晶体结构揭示构象调节的物理基础

为验证设计几何，团队解析了FAK激酶结构域与激活剂FAK_A1复合物的2.04 Å晶体结构。以激酶链叠合后，结合蛋白主链与设计模型的偏差约为1.0 Å，结合蛋白自身折叠的主链RMSD仅0.28 Å，说明设计界面在接近原子级精度上得到实验复现。FAK_A1横跨激酶N端叶、C端叶及连接两者的铰链区，并未引发激酶核心的大规模变形。FAK_A1、FAK_A2、FAK_I1和FAK_I2模型的C端叶高度重合，Cα RMSD为0.15–0.30 Å，但N端叶相对位置不同。跨49个AlphaFold3模型分析发现，430–552位Cα距离与活性倍数呈负相关，Pearson r为−0.60：激活设计接近紧凑的参考几何，抑制设计则对应更开放或位移的ATP口袋邻近构象。

图3 FAK_A1晶体结构与设计模型高度吻合。局部ATP口袋几何与功能输出相关，430–552位Cα距离增大与活性降低相关（r=−0.60，n=49）。

选择性来自非保守表面，而非保守ATP口袋

选择性是激酶调节剂能否成为可靠工具的关键。研究在2 μM条件下，将FAK_I1和FAK_I2对FAK、IRAK4、EGFR、CK1γ1、ROCK1、GSK3β、SYK、MNK1、MAPKAPK2和ZAP70组成的10种激酶面板进行测试。该浓度约为FAK_I1 IC50的90倍、FAK_I2 IC50的120倍。即便远高于半数抑制浓度，两种设计仍强烈抑制FAK，而对其他激酶的作用显著较低或可忽略，其中包括与FAK较接近的酪氨酸激酶EGFR、SYK和ZAP70。结果支持通过非保守构象表面获得选择性的设想，但面板只覆盖10种激酶，尚不能替代更全面的激酶组、蛋白组和细胞脱靶评估。

图4 FAK_I1和FAK_I2在2 μM下的激酶选择性。两种设计强烈抑制FAK，而对面板中其他9种激酶的影响较低或可忽略。

在细胞中实现FAK信号的抑制与增强

团队通过慢病毒在FAK扩增且依赖FAK的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中稳定表达四种设计蛋白。所有调节蛋白都能不同程度保护内源FAK免受PROTAC BSJ-04-146降解，提供了细胞内靶点结合的独立证据。与体外结果一致，FAK_I1和FAK_I2降低FAK主要自磷酸化位点Y397的磷酸化，而FAK_A1和FAK_A2提高其磷酸化水平。

功能表型也呈相反方向。抑制剂减少细胞在I型胶原表面的铺展面积和黏着斑数量，激活剂则增强细胞铺展并增加黏着斑。FAK_I1和FAK_I2还显著降低MDA-MB-231三维球体的细胞活力；在胰腺导管腺癌细胞PATU-8988T中，两者同样降低磷酸化FAK和三维球体活力。图5中的铺展与黏着斑数据来自3次独立实验、每个条件超过15个细胞；三维球体实验每组包含10–20个生物学独立样本，并代表3次独立实验。

图5 设计蛋白在细胞内双向调节FAK信号与表型。抑制剂降低Y397磷酸化、细胞铺展、黏着斑和三维球体活力，激活剂产生相反的黏附表型。

从FAK重定向至Src：成功骨架可以快速改造

为检验方法的可迁移性，研究以成功的FAK抑制骨架为起点，把靶标替换为处于非活性或SH2结合构象的Src激酶，再通过RFdiffusion部分扩散重塑界面、ProteinMPNN重新设计序列，并用AlphaFold2筛选。与每个新靶点完全从零开始相比，这种策略保留总体骨架架构，只重构与新激酶接触的区域。

在HEK293细胞中，研究使用全长或截短Src与CD247 ITAM报告系统，通过全局磷酸酪氨酸信号和CD247 pY142位点评估活性。Src_I1产生最强且最稳定的抑制，Src_I2在两种Src背景中也降低两类读数；其他设计表现出不同程度的结构背景依赖性。这表明FAK设计不只是偶然命中，已验证骨架可以作为新激酶调节剂的界面重设计起点。

遗传编码还赋予这类调节剂区别于小分子的实验优势。设计蛋白可以与细胞类型特异启动子、亚细胞定位序列、光控或化学诱导模块融合，在特定时间和位置持续改变激酶状态；抑制剂和激活剂成对使用，还能帮助区分一个表型究竟来自FAK缺失、催化降低还是活性增强。这种双向扰动对于解析信号网络因果关系尤其重要，也可能用于构建带反馈控制的合成细胞回路，但所有这些用途仍需逐项实验证明。

总结：从抑制剂设计迈向可编程的激酶状态控制

这项工作把激酶设计从“寻找一个能结合的蛋白”推进到“规定结合后把活性推向哪个方向”。96个候选中获得33个功能调节剂，低纳摩尔抑制、超过两倍激活、2.04 Å结构验证、有限激酶面板中的高选择性，以及细胞内相反方向的信号和黏附表型，共同构成较完整的证据链。其科学价值不仅是得到FAK抑制剂，还在于证明构象敏感表面可以成为可编程的酶活性控制位点。

局限同样明确：选择性面板规模有限；细胞实验依赖稳定遗传表达，尚未检验体内递送、药代稳定性、免疫原性和动物或人体安全性；Src重定向主要提供细胞报告系统证据，尚未达到FAK部分的生化和结构验证深度。因此，这些小蛋白更适合被视为信号机制研究工具、空间或时间可控系统的构件，以及发现新型调节位点的起点。若递送和系统级特异性问题能够解决，遗传编码的激酶激活剂与抑制剂有望补充传统小分子，支持持续、细胞类型特异或亚细胞定位的信号调控。

参考链接

https://doi.org/10.64898/2026.07.10.737808