在药物研发里，我们常说“药物找靶点”，但现实往往比更加复杂：一个小分子药物并不一定只作用于一个蛋白。更麻烦也更有价值的是，有些蛋白明明不是“亲戚”，序列不像、整体结构也不像，却可能因为局部结合口袋的形状、电荷和化学环境相似，而被同一种药物识别。弄清这些非同源蛋白之间的药物共享关系，一方面可以帮助我们提前发现意想不到的脱靶风险和副作用，另一方面也可能为老药新用、多靶点药物设计打开新的入口。正因如此，这类方法的意义在于突破单纯比较“两个蛋白像不像”的限制，来回答一个更贴近药物研发的问题：哪些看似无关的蛋白，可能会被同一类小分子结合？

近日，中国科学院上海药物研究所李叙潼、张素林、郑明月团队在Journal of Medicinal Chemistry上发表题为“Mapping Non-Homologous Pocket Compatibilities to Identify Hidden Drug-Target Relationships: A Pocket Hopping Framework”的研究论文。该研究从“结构不同的蛋白为何仍可能结合相同配体”这一问题出发，构建非同源共配体口袋数据集，建立Pocket Hopping模型，从共配体蛋白口袋中学习残基水平的相互作用模式，用于发现潜在的跨靶点配体关系，并在WRN和ENPP1两个体系中完成实验验证。

1. 引言

小分子与蛋白质之间的相互作用预测是药物发现中的基础问题。许多生物活性化合物并非只作用于一个靶点，而是能够与多个蛋白发生结合。这些多靶点作用既可能带来新的治疗机会，也可能影响药物的疗效和安全性。因此，系统识别药物可能作用的其他靶点，对于解释药物作用机制、开展药物重定位和发现新的先导化合物都具有重要意义。

现有方法通常从配体化学相似性、蛋白序列同源性、整体结构或口袋形状相似性出发寻找药物-靶点关系。这些方法适合分析同一家族或结构较为接近的蛋白，但当两个蛋白缺乏序列同源性，整体折叠和口袋形状也明显不同时，即使它们能够结合相同配体，传统方法仍很难建立二者之间的联系。Pocket Hopping的基本思路是，以共享配体作为监督信号，从大量非同源蛋白口袋中学习残基层面的相互作用规律，从而寻找结构不同但对相同化学类型具有结合兼容性的蛋白口袋。

2. 结果与讨论

2.1 构建非同源共配体口袋数据集

为了研究非同源蛋白之间是否存在可学习的配体识别关系，研究人员首先整合PDB中的蛋白质-配体复合物结构和BindingDB中的活性数据，构建了一个以共配体关系为核心的基准数据集（图1A-C）。数据处理过程中，团队筛选具有药物样特征的配体和质量可靠的复合物结构，并排除序列相近的蛋白质。能够结合同一活性化合物或同一共晶配体的非同源蛋白被定义为阳性样本；阴性样本则在匹配蛋白序列相似性分布的同时，要求对应配体之间缺乏明显的化学相似性。训练集、验证集和测试集也按照蛋白聚类结果进行划分，以尽量减少相近蛋白分布在不同数据集所造成的信息泄漏。

在此基础上，研究人员比较了序列、整体结构和传统口袋相似性方法的预测能力。在完整数据集中，这些方法看起来仍有一定区分能力；但进一步去除具有相似折叠的蛋白对后，各类传统方法的性能均明显下降，接近随机水平（图1D）。这一结果说明，真正非同源蛋白之间的共配体关系通常没有清晰的序列或几何线索，单纯比较序列、折叠或口袋形状难以解决这一问题，需要进一步学习与配体识别有关的残基相互作用特征

图1. 用于学习非同源蛋白配体识别模式的大规模数据集构建与特征分析。（A）阳性样本为共享同一活性化合物或同一共晶配体的非同源蛋白对。（B）阴性样本匹配阳性样本的序列相似性分布，并要求对应配体的ECFP4 Tanimoto相似性不高于0.3。（C）结合位点定义为配体周围8 Å范围内的残基；排除Smith-Waterman相似性高于0.3的蛋白对后，共获得36,569对阳性样本和55,203对阴性样本。（D）进一步采用TM-score低于0.5的标准去除具有相似折叠的蛋白对，保留15,236组阳性样本；此时传统序列、结构和口袋比较方法的AUROC接近0.5。

2.2 Pocket Hopping突破非同源蛋白共享的配体识别特征

结构不相关的蛋白质可以通过多种方式识别同一配体。如图2A所示，有些蛋白使用相似残基识别相同的配体基团；有些蛋白虽然使用不同残基，但仍形成相同类型的相互作用；还有一些蛋白分别识别配体的不同部分，通过不同的残基组合维持关键药效团作用。严格的结构过滤主要保留后两类情况，而这些关系恰恰缺少明显的几何对应，也是传统结构和口袋匹配方法最难处理的部分。

受药物化学中骨架跃迁概念的启发，研究人员提出了Pocket Hopping，即在蛋白质空间中寻找结构不同但能够兼容相同或相近化学类型的结合口袋（图2B）。模型将每个口袋表示为残基图，节点包含残基类型、二级结构、溶剂可及性和主链构象等信息，空间邻近的残基之间建立连接；随后利用图注意力网络整合局部残基环境，得到口袋级表示，并判断两个口袋是否可能共享配体识别能力（图2C）。在内部测试集和两个独立外部数据集上，Pocket Hopping均优于传统序列、结构和口袋比较方法；即使采用严格的结构差异标准，模型仍保持较好的预测性能（图2D-G）。

图2. Pocket Hopping的概念、模型框架与性能。（A）结构不相关蛋白识别同一配体的三类代表性模式。（B）从配体骨架跃迁到蛋白口袋跃迁的概念拓展。（C）口袋以残基图表示，节点包含残基类型、DSSP二级结构、相对溶剂可及面积及主链二面角等信息，Cα距离不超过6 Å的残基之间建立边；图注意力网络生成512维口袋表示，两个口袋表示加和后输入两层神经网络进行分类。（D-E）完整测试集和TM-score低于0.5测试集上的AUROC分别为0.968和0.955。（F-G）在Barelier和Vertex外部数据集上的Recall和AUROC分别为0.435和0.917。

2.3 通过残基水平归因实现口袋跃迁的机制可解释性

为了判断模型是否真正利用了与配体识别有关的残基信息，研究人员进一步开展了残基掩蔽分析，即依次遮蔽口袋中的单个残基或残基组合，观察模型预测分数的变化。研究选择NOD13和AHK4作为代表性案例。两种蛋白均能结合苄氨基嘌呤EMU，但它们的整体结构、口袋形状和表面特征差异明显，传统结构和口袋比较方法难以识别二者之间的关系，而Pocket Hopping给出了较高的兼容性判断（图3A）。

掩蔽分析在两个口袋中分别识别出少数对预测结果影响较大的残基，同时遮蔽两侧关键位点时，模型分数进一步下降（图3B）。随后对共晶结构进行检查发现，模型识别出的代表性残基虽然来自不同蛋白，却分别参与了EMU嘌呤基团的氢键作用（图3C）。这说明模型关注的是不同口袋中功能相当的配体作用位点，而不是简单寻找形状相似或空间位置一一对应的残基。残基水平的归因结果也为后续结合模式分析和实验验证提供了明确线索。

图3. Pocket Hopping模型的可解释性分析。（A）NOD13和AHK4均结合配体EMU，Pocket Hopping预测概率为0.8024，而传统口袋和结构比较方法未能有效识别。（B）单残基和双残基掩蔽分析显示，NOD13中的Gln68、Asp132、Tyr133和Leu134，以及AHK4中的Leu284、Glu285和Thr286对预测结果影响较大。（C）共晶结构表明，NOD13的Gln68和AHK4的Leu284均参与EMU嘌呤基团的氢键作用。

2.4 自动化筛选流程的搭建

为了将模型用于实际的候选化合物筛选，研究人员进一步建立了蛋白质-位点-配体数据库，即P-S-L数据库（图4A）。该数据库将经过整理的高质量蛋白结合口袋与已知活性配体相连接，并引入DrugSpaceX^[1]生成的结构类似物，对已知配体周围的化学空间进行扩展。这样既可以检索已报道的活性化合物，也可以进一步获得具有相近结构特征、可用于后续筛选的候选分子。

在具体应用中，输入目标蛋白结构后，流程首先自动提取目标口袋并生成残基图表示；随后，Pocket Hopping将目标口袋与P-S-L数据库中的结合位点逐一比较，筛选可能具有相近配体识别能力的非同源口袋。与这些高分口袋相关的已知活性配体及其结构类似物被汇总为候选化合物库，经过可购买性筛选后进入生化和细胞实验（图4B）。这一流程将口袋关系预测、配体检索和实验验证衔接起来，可以较方便地应用于不同靶点。

图4. Pocket Hopping自动化筛选流程。（A）P-S-L数据库由PDB高质量结合位点、DrugBank、BindingDB和PDB中的已知活性配体及DrugSpaceX结构类似物组成，共覆盖7,405种蛋白质、36,188个结合位点和824,883种化合物。（B）目标口袋经过图表示后与数据库口袋比较，再根据高分口袋检索已知配体和类似物，形成候选化合物集合并进入实验验证。

2.5 案例1：WRN先导化合物的发现与作用机制解析

WRN解旋酶是微卫星不稳定性肿瘤中的合成致死靶点，也是近年来抗肿瘤药物研究的重要方向。虽然已有多个WRN抑制剂进入开发阶段，但耐药和化学类型相对有限等问题仍提示需要寻找新的起始结构。因此，研究人员以WRN的ATP结合口袋作为查询对象，利用Pocket Hopping筛选可能与其共享配体识别特征的非同源蛋白口袋（图5A）。

模型预测结果显示，BRD4相关口袋在排名靠前的匹配对象中较为突出。口袋表征的二维投影也显示，同一靶点来源的口袋能够形成相对清晰的聚类，说明模型在学习跨蛋白兼容性的同时，仍保留了靶点自身的结构和化学特征（图5B）。基于排名靠前的口袋及其已知配体，研究人员建立了聚焦化合物集合，并选择其中可购买的候选分子开展实验筛选。

实验结果发现，菲卓替尼能够抑制WRN解旋酶活性，电泳迁移率变动分析进一步证实其对DNA解旋过程具有剂量依赖性抑制作用，核磁共振实验则支持其与WRN直接结合（图5C-E）。在此基础上，研究人员对菲卓替尼（Fedratinib, 14C9）相关结构进行类似物扩展，获得活性更高的化合物2C2，并通过核磁共振和表面等离子体共振验证其直接结合WRN（图5F-J）。残基掩蔽分析和分子对接均提示S548是重要作用位点；将该残基突变为丙氨酸后，2C2与WRN的结合显著降低（图5K-L）。这一案例表明，Pocket Hopping不仅能够提供候选化学类型，还可以进一步给出与结合机制有关的残基线索。

图5. 基于Pocket Hopping模型发现新型WRN抑制剂。（A-B）以WRN结构PDB: 6YHR为查询，从排名靠前的50个口袋关联靶点中选取74种市售化合物进行实验筛选，BRD4结合化学类型在候选中占据重要位置。（C-E）菲卓替尼14C9抑制WRN解旋酶活性，IC50为56.1±10.8 μM，并经EMSA和NMR验证。（F-J）类似物扩展获得2C2，其WRN抑制活性提高至11.4±0.6 μM，SPR测得KD为5.19 μM。（K-L）残基掩蔽和对接均提示S548参与2C2结合；S548A突变后，2C2结合接近消失。

2.6 案例2：挖掘潜在的双靶点活性

ENPP1能够水解cGAMP并抑制STING信号，在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用。现有研究表明，单独抑制ENPP1的抗肿瘤作用可能受到肿瘤复杂调控网络的限制，因此，同时具有ENPP1抑制活性和其他药理作用的化合物可能具有进一步研究价值。基于这一考虑，研究人员以ENPP1结合口袋作为查询对象，在P-S-L数据库中筛选可能与其共享配体识别特征的非同源蛋白口袋。

Pocket Hopping将HDAC8口袋列为高度匹配对象，并据此检索相关已知配体。实验筛选发现，处于临床研究阶段的HDAC抑制剂艾贝司他（Abexinostat, ABE）能够抑制ENPP1活性。尽管ENPP1与HDAC8在序列和整体结构上均缺乏明显相似性，模型仍预测二者可能兼容相同化学类型。核磁共振和表面等离子体共振实验进一步证实艾贝司他可直接结合ENPP1；在相同测试条件下，该化合物对同源蛋白ENPP2和ENPP3未显示明显抑制。分子对接也给出了其在ENPP1催化口袋中的可能结合方式（图6A-H）。

研究人员随后在THP-1来源巨噬细胞中考察了艾贝司他对cGAMP-STING信号的影响。结果显示，艾贝司他能够剂量依赖性增强cGAMP诱导的IFNB1、CXCL10和IL6转录，而单独使用该化合物并未产生同样的作用（图6I-K）。这些结果支持艾贝司他具有此前未被认识的ENPP1抑制活性，并提示其可能同时具有HDAC和ENPP1双重药理作用。该发现也说明，Pocket Hopping可以用于提出并验证结构上缺乏明显关联的多靶点作用假设。

图6. 基于Pocket Hopping模型发现艾贝司他的ENPP1抑制活性。（A-G）从排名靠前的50个口袋关联靶点中选取79种市售化合物进行筛选。Pocket Hopping给出的ENPP1-HDAC8共配体概率为0.9992，二者的序列和结构相似性分别为0.1806和0.3049。艾贝司他抑制ENPP1的IC50为6.82±0.75 μM，在100 μM时对ENPP2和ENPP3无明显抑制；SPR测得动力学KD和稳态KD分别为3.08 μM和1.53 μM。（H）艾贝司他在ENPP1口袋中的预测结合模式。（I-K）在1 μM cGAMP刺激下，艾贝司他剂量依赖性增强THP-1来源巨噬细胞中IFNB1、CXCL10和IL6的mRNA表达。

3. 结论

本研究提出Pocket Hopping方法，通过共配体监督学习非同源蛋白口袋的残基级结合兼容性，从而补充传统序列、结构和口袋相似性方法在非同源蛋白关系识别方面的不足。WRN和ENPP1两个案例表明，该方法可以从口袋关系出发检索候选化合物，发现已知药物的潜在新靶点，并通过残基归因分析为结合模式研究和后续结构优化提供线索。该方法目前仍依赖结构数据库中已有的结合位点和配体信息，未来随着实验复合物结构和高质量预测结构的持续积累，其可分析的蛋白质范围有望进一步扩大。

上海药物研究所联合培养研究生张莹莹、香港大学博士后杨天标以及上海药物研究所研究生牛步盈为本文共同第一作者。上海药物研究所李叙潼副研究员、张素林研究员与郑明月研究员为论文通讯作者。本研究得到中国科学院战略性先导科技专项、国家自然科学基金、杭州高等研究院研究基金等项目支持。

参考文献

Yang, T. et al. DrugSpaceX: a large screenable and synthetically tractable database extending drug space. Nucleic Acids Res. 49, D1170–D1178 (2021).

原文链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.6c01050.

在药物研发里，我们常说“药物找靶点”，但现实往往比更加复杂：一个小分子药物并不一定只作用于一个蛋白。更麻烦也更有价值的是，有些蛋白明明不是“亲戚”，序列不像、整体结构也不像，却可能因为局部结合口袋的形状、电荷和化学环境相似，而被同一种药物识别。弄清这些非同源蛋白之间的药物共享关系，一方面可以帮助我们提前发现意想不到的脱靶风险和副作用，另一方面也可能为老药新用、多靶点药物设计打开新的入口。正因如此，这类方法的意义在于突破单纯比较“两个蛋白像不像”的限制，来回答一个更贴近药物研发的问题：哪些看似无关的蛋白，可能会被同一类小分子结合？

近日，中国科学院上海药物研究所李叙潼、张素林、郑明月团队在Journal of Medicinal Chemistry上发表题为“Mapping Non-Homologous Pocket Compatibilities to Identify Hidden Drug-Target Relationships: A Pocket Hopping Framework”的研究论文。该研究从“结构不同的蛋白为何仍可能结合相同配体”这一问题出发，构建非同源共配体口袋数据集，建立Pocket Hopping模型，从共配体蛋白口袋中学习残基水平的相互作用模式，用于发现潜在的跨靶点配体关系，并在WRN和ENPP1两个体系中完成实验验证。

1. 引言

小分子与蛋白质之间的相互作用预测是药物发现中的基础问题。许多生物活性化合物并非只作用于一个靶点，而是能够与多个蛋白发生结合。这些多靶点作用既可能带来新的治疗机会，也可能影响药物的疗效和安全性。因此，系统识别药物可能作用的其他靶点，对于解释药物作用机制、开展药物重定位和发现新的先导化合物都具有重要意义。

现有方法通常从配体化学相似性、蛋白序列同源性、整体结构或口袋形状相似性出发寻找药物-靶点关系。这些方法适合分析同一家族或结构较为接近的蛋白，但当两个蛋白缺乏序列同源性，整体折叠和口袋形状也明显不同时，即使它们能够结合相同配体，传统方法仍很难建立二者之间的联系。Pocket Hopping的基本思路是，以共享配体作为监督信号，从大量非同源蛋白口袋中学习残基层面的相互作用规律，从而寻找结构不同但对相同化学类型具有结合兼容性的蛋白口袋。

2. 结果与讨论

2.1 构建非同源共配体口袋数据集

为了研究非同源蛋白之间是否存在可学习的配体识别关系，研究人员首先整合PDB中的蛋白质-配体复合物结构和BindingDB中的活性数据，构建了一个以共配体关系为核心的基准数据集（图1A-C）。数据处理过程中，团队筛选具有药物样特征的配体和质量可靠的复合物结构，并排除序列相近的蛋白质。能够结合同一活性化合物或同一共晶配体的非同源蛋白被定义为阳性样本；阴性样本则在匹配蛋白序列相似性分布的同时，要求对应配体之间缺乏明显的化学相似性。训练集、验证集和测试集也按照蛋白聚类结果进行划分，以尽量减少相近蛋白分布在不同数据集所造成的信息泄漏。

在此基础上，研究人员比较了序列、整体结构和传统口袋相似性方法的预测能力。在完整数据集中，这些方法看起来仍有一定区分能力；但进一步去除具有相似折叠的蛋白对后，各类传统方法的性能均明显下降，接近随机水平（图1D）。这一结果说明，真正非同源蛋白之间的共配体关系通常没有清晰的序列或几何线索，单纯比较序列、折叠或口袋形状难以解决这一问题，需要进一步学习与配体识别有关的残基相互作用特征

图1. 用于学习非同源蛋白配体识别模式的大规模数据集构建与特征分析。（A）阳性样本为共享同一活性化合物或同一共晶配体的非同源蛋白对。（B）阴性样本匹配阳性样本的序列相似性分布，并要求对应配体的ECFP4 Tanimoto相似性不高于0.3。（C）结合位点定义为配体周围8 Å范围内的残基；排除Smith-Waterman相似性高于0.3的蛋白对后，共获得36,569对阳性样本和55,203对阴性样本。（D）进一步采用TM-score低于0.5的标准去除具有相似折叠的蛋白对，保留15,236组阳性样本；此时传统序列、结构和口袋比较方法的AUROC接近0.5。

2.2 Pocket Hopping突破非同源蛋白共享的配体识别特征

结构不相关的蛋白质可以通过多种方式识别同一配体。如图2A所示，有些蛋白使用相似残基识别相同的配体基团；有些蛋白虽然使用不同残基，但仍形成相同类型的相互作用；还有一些蛋白分别识别配体的不同部分，通过不同的残基组合维持关键药效团作用。严格的结构过滤主要保留后两类情况，而这些关系恰恰缺少明显的几何对应，也是传统结构和口袋匹配方法最难处理的部分。

受药物化学中骨架跃迁概念的启发，研究人员提出了Pocket Hopping，即在蛋白质空间中寻找结构不同但能够兼容相同或相近化学类型的结合口袋（图2B）。模型将每个口袋表示为残基图，节点包含残基类型、二级结构、溶剂可及性和主链构象等信息，空间邻近的残基之间建立连接；随后利用图注意力网络整合局部残基环境，得到口袋级表示，并判断两个口袋是否可能共享配体识别能力（图2C）。在内部测试集和两个独立外部数据集上，Pocket Hopping均优于传统序列、结构和口袋比较方法；即使采用严格的结构差异标准，模型仍保持较好的预测性能（图2D-G）。

图2. Pocket Hopping的概念、模型框架与性能。（A）结构不相关蛋白识别同一配体的三类代表性模式。（B）从配体骨架跃迁到蛋白口袋跃迁的概念拓展。（C）口袋以残基图表示，节点包含残基类型、DSSP二级结构、相对溶剂可及面积及主链二面角等信息，Cα距离不超过6 Å的残基之间建立边；图注意力网络生成512维口袋表示，两个口袋表示加和后输入两层神经网络进行分类。（D-E）完整测试集和TM-score低于0.5测试集上的AUROC分别为0.968和0.955。（F-G）在Barelier和Vertex外部数据集上的Recall和AUROC分别为0.435和0.917。

2.3 通过残基水平归因实现口袋跃迁的机制可解释性

为了判断模型是否真正利用了与配体识别有关的残基信息，研究人员进一步开展了残基掩蔽分析，即依次遮蔽口袋中的单个残基或残基组合，观察模型预测分数的变化。研究选择NOD13和AHK4作为代表性案例。两种蛋白均能结合苄氨基嘌呤EMU，但它们的整体结构、口袋形状和表面特征差异明显，传统结构和口袋比较方法难以识别二者之间的关系，而Pocket Hopping给出了较高的兼容性判断（图3A）。

掩蔽分析在两个口袋中分别识别出少数对预测结果影响较大的残基，同时遮蔽两侧关键位点时，模型分数进一步下降（图3B）。随后对共晶结构进行检查发现，模型识别出的代表性残基虽然来自不同蛋白，却分别参与了EMU嘌呤基团的氢键作用（图3C）。这说明模型关注的是不同口袋中功能相当的配体作用位点，而不是简单寻找形状相似或空间位置一一对应的残基。残基水平的归因结果也为后续结合模式分析和实验验证提供了明确线索。

图3. Pocket Hopping模型的可解释性分析。（A）NOD13和AHK4均结合配体EMU，Pocket Hopping预测概率为0.8024，而传统口袋和结构比较方法未能有效识别。（B）单残基和双残基掩蔽分析显示，NOD13中的Gln68、Asp132、Tyr133和Leu134，以及AHK4中的Leu284、Glu285和Thr286对预测结果影响较大。（C）共晶结构表明，NOD13的Gln68和AHK4的Leu284均参与EMU嘌呤基团的氢键作用。

2.4 自动化筛选流程的搭建

为了将模型用于实际的候选化合物筛选，研究人员进一步建立了蛋白质-位点-配体数据库，即P-S-L数据库（图4A）。该数据库将经过整理的高质量蛋白结合口袋与已知活性配体相连接，并引入DrugSpaceX^[1]生成的结构类似物，对已知配体周围的化学空间进行扩展。这样既可以检索已报道的活性化合物，也可以进一步获得具有相近结构特征、可用于后续筛选的候选分子。

在具体应用中，输入目标蛋白结构后，流程首先自动提取目标口袋并生成残基图表示；随后，Pocket Hopping将目标口袋与P-S-L数据库中的结合位点逐一比较，筛选可能具有相近配体识别能力的非同源口袋。与这些高分口袋相关的已知活性配体及其结构类似物被汇总为候选化合物库，经过可购买性筛选后进入生化和细胞实验（图4B）。这一流程将口袋关系预测、配体检索和实验验证衔接起来，可以较方便地应用于不同靶点。

图4. Pocket Hopping自动化筛选流程。（A）P-S-L数据库由PDB高质量结合位点、DrugBank、BindingDB和PDB中的已知活性配体及DrugSpaceX结构类似物组成，共覆盖7,405种蛋白质、36,188个结合位点和824,883种化合物。（B）目标口袋经过图表示后与数据库口袋比较，再根据高分口袋检索已知配体和类似物，形成候选化合物集合并进入实验验证。

2.5 案例1：WRN先导化合物的发现与作用机制解析

WRN解旋酶是微卫星不稳定性肿瘤中的合成致死靶点，也是近年来抗肿瘤药物研究的重要方向。虽然已有多个WRN抑制剂进入开发阶段，但耐药和化学类型相对有限等问题仍提示需要寻找新的起始结构。因此，研究人员以WRN的ATP结合口袋作为查询对象，利用Pocket Hopping筛选可能与其共享配体识别特征的非同源蛋白口袋（图5A）。

模型预测结果显示，BRD4相关口袋在排名靠前的匹配对象中较为突出。口袋表征的二维投影也显示，同一靶点来源的口袋能够形成相对清晰的聚类，说明模型在学习跨蛋白兼容性的同时，仍保留了靶点自身的结构和化学特征（图5B）。基于排名靠前的口袋及其已知配体，研究人员建立了聚焦化合物集合，并选择其中可购买的候选分子开展实验筛选。

实验结果发现，菲卓替尼能够抑制WRN解旋酶活性，电泳迁移率变动分析进一步证实其对DNA解旋过程具有剂量依赖性抑制作用，核磁共振实验则支持其与WRN直接结合（图5C-E）。在此基础上，研究人员对菲卓替尼（Fedratinib, 14C9）相关结构进行类似物扩展，获得活性更高的化合物2C2，并通过核磁共振和表面等离子体共振验证其直接结合WRN（图5F-J）。残基掩蔽分析和分子对接均提示S548是重要作用位点；将该残基突变为丙氨酸后，2C2与WRN的结合显著降低（图5K-L）。这一案例表明，Pocket Hopping不仅能够提供候选化学类型，还可以进一步给出与结合机制有关的残基线索。

图5. 基于Pocket Hopping模型发现新型WRN抑制剂。（A-B）以WRN结构PDB: 6YHR为查询，从排名靠前的50个口袋关联靶点中选取74种市售化合物进行实验筛选，BRD4结合化学类型在候选中占据重要位置。（C-E）菲卓替尼14C9抑制WRN解旋酶活性，IC50为56.1±10.8 μM，并经EMSA和NMR验证。（F-J）类似物扩展获得2C2，其WRN抑制活性提高至11.4±0.6 μM，SPR测得KD为5.19 μM。（K-L）残基掩蔽和对接均提示S548参与2C2结合；S548A突变后，2C2结合接近消失。

2.6 案例2：挖掘潜在的双靶点活性

ENPP1能够水解cGAMP并抑制STING信号，在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用。现有研究表明，单独抑制ENPP1的抗肿瘤作用可能受到肿瘤复杂调控网络的限制，因此，同时具有ENPP1抑制活性和其他药理作用的化合物可能具有进一步研究价值。基于这一考虑，研究人员以ENPP1结合口袋作为查询对象，在P-S-L数据库中筛选可能与其共享配体识别特征的非同源蛋白口袋。

Pocket Hopping将HDAC8口袋列为高度匹配对象，并据此检索相关已知配体。实验筛选发现，处于临床研究阶段的HDAC抑制剂艾贝司他（Abexinostat, ABE）能够抑制ENPP1活性。尽管ENPP1与HDAC8在序列和整体结构上均缺乏明显相似性，模型仍预测二者可能兼容相同化学类型。核磁共振和表面等离子体共振实验进一步证实艾贝司他可直接结合ENPP1；在相同测试条件下，该化合物对同源蛋白ENPP2和ENPP3未显示明显抑制。分子对接也给出了其在ENPP1催化口袋中的可能结合方式（图6A-H）。

研究人员随后在THP-1来源巨噬细胞中考察了艾贝司他对cGAMP-STING信号的影响。结果显示，艾贝司他能够剂量依赖性增强cGAMP诱导的IFNB1、CXCL10和IL6转录，而单独使用该化合物并未产生同样的作用（图6I-K）。这些结果支持艾贝司他具有此前未被认识的ENPP1抑制活性，并提示其可能同时具有HDAC和ENPP1双重药理作用。该发现也说明，Pocket Hopping可以用于提出并验证结构上缺乏明显关联的多靶点作用假设。

图6. 基于Pocket Hopping模型发现艾贝司他的ENPP1抑制活性。（A-G）从排名靠前的50个口袋关联靶点中选取79种市售化合物进行筛选。Pocket Hopping给出的ENPP1-HDAC8共配体概率为0.9992，二者的序列和结构相似性分别为0.1806和0.3049。艾贝司他抑制ENPP1的IC50为6.82±0.75 μM，在100 μM时对ENPP2和ENPP3无明显抑制；SPR测得动力学KD和稳态KD分别为3.08 μM和1.53 μM。（H）艾贝司他在ENPP1口袋中的预测结合模式。（I-K）在1 μM cGAMP刺激下，艾贝司他剂量依赖性增强THP-1来源巨噬细胞中IFNB1、CXCL10和IL6的mRNA表达。

3. 结论

本研究提出Pocket Hopping方法，通过共配体监督学习非同源蛋白口袋的残基级结合兼容性，从而补充传统序列、结构和口袋相似性方法在非同源蛋白关系识别方面的不足。WRN和ENPP1两个案例表明，该方法可以从口袋关系出发检索候选化合物，发现已知药物的潜在新靶点，并通过残基归因分析为结合模式研究和后续结构优化提供线索。该方法目前仍依赖结构数据库中已有的结合位点和配体信息，未来随着实验复合物结构和高质量预测结构的持续积累，其可分析的蛋白质范围有望进一步扩大。

上海药物研究所联合培养研究生张莹莹、香港大学博士后杨天标以及上海药物研究所研究生牛步盈为本文共同第一作者。上海药物研究所李叙潼副研究员、张素林研究员与郑明月研究员为论文通讯作者。本研究得到中国科学院战略性先导科技专项、国家自然科学基金、杭州高等研究院研究基金等项目支持。

参考文献

Yang, T. et al. DrugSpaceX: a large screenable and synthetically tractable database extending drug space. Nucleic Acids Res. 49, D1170–D1178 (2021).

原文链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.6c01050.